完整透明大脑三维成像你见过吗？——解锁CLARITY组织清理新技能！
作者丨光哥哥（EffieLiu）纽约州立大学石溪分校神经生物学硕士生
编辑丨浦肯野
排版丨哈里
划重点：今天给大家介绍一个叫做 CLARITY（ClearLipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/Insitu hybridization-compatible Tissue-hYdrogel）的技术/方法。
CLARITY是一种使组织透明化的清理技术，它通过水凝胶固定完整的组织，在保存完整的组织框架结构的情况下，原位保留蛋白质和核酸，剔除其他组织成分如脂质，让大脑变得“透明”进而实现三维成像。这项技术可以使我们探究大脑功能时能更接近真实情况，特别是有助于我们理解神经系统中的互相联系。此外，该项技术在2013年曾入选Science杂志的“十大突破”之一，评语是，“此技术改变了研究者看待和研究大脑这个错综复杂器官的方式！”
先让大家观赏关于这项技术的官方视频（现在都是流量不限量啦，各位也不需要在wifi下才能观看咯）：
与常见的黑白CT，MRI图，以及稍微有那么一点颜色的免疫组化图相比，这些色彩鲜艳的3D高清大图肯定让你眼前一亮吧！他们怎样拍出完整大脑的三维视频呢？接下来我们就来一步步揭开它的炫彩面纱！
图1 左：“低配版”图；右：“高配版”
1、传统大脑切片成像的局限
为了研究突触、神经元及神经环路等大脑组织，我们通常需要对大脑组织进行切片、染色、成像。但其实大脑中有千千万万个神经元和突触，各个神经细胞之间也有着千丝万缕的联系，而它们的联系是三维的。单纯对大脑组织进行纵轴或者横轴方向的切片，难免让我们忽略切片以外的相互联系。特别在研究大脑功能与结构关系的方面，能够在完整的大脑结构上展开实验是十分有必要且迫切需要的。但是，为什么我们不能对整个大脑进行染色，然后直接通过激光共聚焦显微镜或者其他荧光显微镜进行检测呢？
2.完整组织3D成像的难关
首先，我们来看看对大脑整体进行成像面临的几个技术问题：
（1）穿透力（Penetration）整个大脑是实心的，如果对整个大脑进行成像，需要显微镜发射出很强的光源。但光强度越大，被免疫染色的物质越容易发生荧光猝灭，导致最后的成像效果不理想。
而且，现有的激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）也只能到达大脑表面以下约150μm的深度；即使是穿透力较高的双光子激发荧光显微镜（TPEFM）也不能超过大脑表面以下500μm的深度。
（2）光散射（Light scatter）由于细胞膜是由脂质双分子层组成的，且大脑中也还有很多的脂质，这些脂质能将光散射，从而削弱光强度。这又回到了第一个技术问题——即穿透力太弱的问题。
3.完整组织3D成像的突破口
在弄清楚面临的问题以后，CLARITY研发团队就要“搞事情”啦！毕竟人家是一个严谨的科研团队，“搞事情”之前人家还制定了几个“小目标”：
（1）可以迅速将完整的组织变为透明，同时大分子能够穿透（即提高光穿透性并减少光散射）；
（2）同时保持组织的完整性（即不能扰乱整个框架结构）。
随后，CLARITY研发团队针对在保持结构完整性的情况下“如何提高穿透力”和“如何减少光散射”这两个主要问题进行了探索。
之前小编也提到了，脂质双分子层是使得光散射发生的“罪魁祸首”，它会让分子探针和光子难以进入组织内部，削弱了光的穿透力。因此，如果能在不损害其他物质的情况下剔除脂质双分子层，光和大分子便可能穿透进入组织内部，进行完整组织的3D成像和免疫组化荧光分析。
4.CLARITY技术——重点之获得3D完整组织
但是，怎样才能保持组织的完整性呢？保持组织完整性——也就是CLARITY技术的重点。接下来我们就来正式解锁CLARITY（制作大脑3D炫彩高清大图）的新技能啦！
CLARITY技术大致包括以下几个步骤：
Step1: 水凝胶单体融合
Step2: 水凝胶——组织杂交
Step3: 电泳——剔除脂质
Step4: 全组织免疫染色
Step5: 全组织成像
（水凝胶：水凝胶是化学或物理交联而成的具有三维网络结构的高分子材料，其高分子网络中含有大量的水并能保持一定的形状。）
图2. CLARITY流程图。甲醛（红色分子）；丙烯酰胺（蓝色分子）
小编个人认为，CLARITY技术的巧妙之处在于其用水凝胶的方法原位固定了整个组织，然后用电泳除去脂质。在组织固定时加入了甲醛，并且还加入了水凝胶单体（丙烯酰胺）。
甲醛是很好且常用的组织固定剂，其有效固定作用的要点是，在蛋白质末端基团之间形成交联链，保持细胞、组织的固有形态和结构。而同时加入甲醛和水凝胶单体，甲醛不仅与组织发生交联，还作为桥梁把水凝胶单体与组织中的生物分子（如蛋白质、核酸及小分子）连接了起来。然后水凝胶单体在温度升高的驱动下聚合交联形成具有三维网络结构致密水凝胶。此时形成的水凝胶—组织交联体就能够支持和固定组织的整体结构。
此外，由于脂质和其他生物分子缺少与甲醛和水凝胶单体相互作用的功能基团，它们游离于水凝胶—组织交联体之外。所以通过加入SDS（十二烷基硫酸钠，一种表面活性剂）使得脂质形成带负电荷的胶束（图2. Step3），然后进行电泳，带负电荷的胶束便向正极移动，富集，最后除去。这样我们就能得到仅含有蛋白质和核酸的完整大脑结构了。
图3. 脑组织经历CLARITY技术处理前后对比
图3为小鼠大脑经CLARITY技术处理前后的对比图。很明显，在经过CLARITY技术处理的大脑组织变得非常透明。
获得透明的组织以后，根据实验需要对其进行相应蛋白的染色，抗体洗脱，成像（图4）。图4从不同视角显现出经CLARITY处理后的小鼠大脑染色均匀且成像清晰。较为成功地解决了文章开头提到的两个技术问题：如何提高光穿透力和减少光散射。
图4. 经CLARITY技术处理后的小鼠大脑成像不同视角。（P: Posterior 后, A: Anterior 前; D: Dorsal 背部; V: Ventral 腹侧）
图5. 经CLARITY技术处理后的成年小鼠全脑3D图像。从上到下：大脑新皮质；海马；丘脑。
图6是成年斑马鱼大脑经过CLARITY技术处理（水凝胶杂交，脂质清除），抗酪氨酸羟化酶抗体（anti-tyrosine hydroxylase, TH）和Alexa Fluor 594染料分别作为一抗和二抗免疫染色后，在25x水浸物镜（water immersion objective）下获得的图像。
图6. 斑马鱼全脑成像（红色：TH；蓝色：自发荧光）
至于三维图像和视频是通过怎样设置和调节参数获得呢？说来惭愧，这已经超出小编的知识范围。希望下次有机会小编我“学成归来”再与大家一同探讨显微镜方面的知识啦！ 文末也附上了参考文献，各位同仁感兴趣的话可以一探究竟。
在CLARITY问世之后，不少科研团队也纷纷加入此行列，有的对CLARITY技术进行优化，也有开发出其他组织清理技术的，如SeeDB，ClearT2，CUBIC，iDISCO，vDISCO等。这些技术与CLARITY技术相比，主要在使组织透明化的试剂，免疫标记以及成像用的显微镜方面有所不同。与CLARITY技术相同，这些技术主要目标还是尽可能让组织透明化，提高免疫荧光分辨率，让成像更加清晰。
总之这些技术上的突破让我们的科学探索更加贴近真实。尤其是在神经科学领域，我们可以通过基因靶向或基因标记的方法来揭示某些基因在投射形成过程中调节轴突导向的作用；研究神经退行性疾病在基因表达、细胞凋亡状况等方面对全脑的影响；以及研究大脑中连接组学的问题等。随着组织处理和成像技术的不断进步，我们也会逐渐深入大脑，揭开它的神秘面纱，为脑部疾病带来新的、有效的治疗方法！
【参考文献】
1.Chung K, Wallace J, Kim SY, et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems.[J]. Nature, 2013, 497(7449):332-337.
2.Renier N, Wu Z, Simon D J, et al. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.[J]. Cell, 2014, 159(4):896-910.
3.Ke MT, Fujimoto S, Imai T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction[J]. Nature Neuroscience, 2013, 16(8):1154.
4.Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain[J]. Nature Neuroscience, 2011, 14(11):1481.
5.https://www.nature.com/news/see-through-brains-clarify-connections-1.12768
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